Антиадгезивное действие средств гигиены как способ профилактики стоматологических заболеваний

Гроссер А.В., Матело С.К., Купец Т.В.

лат. Adhaesio – прилипание
Адгезия - способность сцепления между приведенными в контакт поверхностями двух разнородных тел.
Адгезия возникает как результат действия межмолекулярных сил или сил химического взаимодействия.
Чтобы вызвать болезнь, вирус, бактерия или простейшее должны быть способны прилипнуть к поверхности хотя бы одной какой-то ткани восприимчивого организма-хозяина. Не способные к этому инфекционные агенты сметаются с потенциальных мест инфекции «очистительными» механизмами нормальной жизнедеятельности организма.
Физиологический обмен микроорганизма, в том числе и синтез факторов вирулентности, зависит от того, прикреплен микроорганизм или нет. Сегодня, при создании противомикробных препаратов, антиадгезивное действие считается одним из наиболее перспективных эффектов. По мере накопления научных данных становится очевидным, что антиадгезивное действие не синонимично понятию бактерицидность, и нарушать адгезию микроорганизмов могут соединения, не обладающие антибактериальным действием.
Примером таких веществ могут служить протеолитические ферменты.


Введение

В процессе эволюции между человеком и микроорганизмами полости рта сформировались сложные многокомпонентные и противоречивые отношения. Микробы способствуют перевариванию пищи и синтезу витаминов и в то же время продуцируют органические кислоты, способствующие развитию кариеса; они оказывают мощное позитивное модулирующее действие на иммунную систему организма, и одновременно обеспечивают накопление в зубной бляшке адьювантов и иммуносупрессивных агентов, воздействующих токсически на ткани десны и периодонт, наконец, они являются сильнейшими антагонистами патогенной флоры, и в то же время сами способны к инвазии с последующим развитием серьезных заболеваний. (1, 2)

Сегодня, по мнению специалистов, насчитывается примерно 200 видов патогенных для человека микроорганизмов. Что же касается основной массы существующих микроорганизмов, то их отношения с организмом хозяина могут быть выстроены по следующим моделям: Симбиоз – взаимодействие между адаптированными друг другу организмами, обычно специфичное, благоприятное для каждого из них.
Комменсализм - когда микроб получает выгоду, а организм хозяина, не получая выгоды, в то же время не страдает от контакта с бактерией. Так взаимодействуют с организмом человека большинство представителей нормальной микрофлоры.
Паразитизм - когда организм хозяина может страдать от бактерий, вызывающих болезнь. Следует, однако, отметить, что многие микроорганизмы-комменсалы способны при определенных обстоятельствах вызывать болезни.

В системе человек – микроб общее количество человеческих клеток составляет 10 в 13-ой степени, а микробных – 10 в 14-ой степени – 10 в 15-ой степени. Главное преимущество, которое получают микроорганизмы, сосуществующие с многоклеточными организмами, – стабильность окружающей среды по параметрам температуры, ионному составу, наличию питательных веществ. Оценить, кто же получает от сосуществования большую выгоду, достаточно сложно. По крайней мере, следует признать, что сосуществование бактерий и человека абсолютно равноправно. (3)


Почему микроорганизмы развили способность к адгезии

Все микроорганизмы обладают выраженной способностью прикрепляться к органическим и неорганическим поверхностям. Естественный образ жизни большинства микроорганизмов связан с их закреплением на каких либо субстратах. Размножение в бульонной культуре, используемое в лабораторных условиях, является скорее исключением, чем «правилом» в жизни микроорганизмов.

Среди множества факторов, приносящих очевидную выгоду прикрепления, можно выделить такие как: (4)
- Прикрепление к субстрату, как правило, обеспечивает более выгодные условия доступа к питательным веществам
- Прикрепленные бактерии гораздо легче, чем свободноплавающие, образуют кооперативные структуры с другими видами.
- Прикрепление и последующее размножение микроорга­низмов с образованием микроколоний и/или пленки обеспечи­вает им более выгодные условия существования, связанные, в частности, с противодействием механическому удалению бак­терий из макроорганизма.
- В прикрепленных бактериальных сообществах больше возможностей для обмена генетическим материалом (плазмидами), путь, по которому распространяется в том числе информация о детерминантах резистентности.
- На прикрепленные бактерии в меньшей степени воздействуют токсичные соединения, так как они диффундируют только с одной стороны, и нейтрализуются всем микробным сообщестом, а не одиночной клеткой.
- Для анаэробных форм расположение в глубоких слоях колоний (или тканях) – условие вегетирования.

Прикрепление бактериальных клеток к поверхности это процесс, связанный как с физико-химическими взаимодействиями, так и с биологической активностью. Выделяют две группы механизмов адгезии – неспецифические и специфические.

Неспецифическая адгезия, как правило, обратима. Для описания этого типа адгезии в англоязычной литературе иногда используют термин «docking» (постановка в док). Для описания специфической адгезии, которую считают необратимой, используют термин «anchoring» (заякоревание).

Установление взаимодействия между патогеном и клеткой-мишенью в результате бактериальной адгезии является определяющим звеном в ходе инфекционного про­цесса.


Адгезивность и вирулентность

Доказано, что адгезивность болезне­творных микроорганизмов часто коррелирует с их патогенностью и вирулентностью. (5,6) Arbuthnott, Smith (1979) (7) показали на авирулентном штамме Escherichia coli, что перенесенная плазмида, контролирующая синтез антигена К88, усиливает не только адгезию микроорганизмов к щеточной каемке энтероцитов тон­кого кишечника, но и вирулентность экспериментально изменен­ного штамма. В исследованиях Frost (1975) (8) отмечается, что способность к адгезии у St.aureus и St. agalactiae, вызывающих мастит коров, на несколько порядков выше, чем St. faecalis и Е.coli, редко высевающихся при этом заболевании. На уропатогенном штамме E.Coli было показано, что адгезия к уроэпителию не только приводит к механическому закреплению микроорганизма в новой экологической нише, но и вызывает адекватную новым условиям перестройку метаболизма. Кроме перестройки метаболизма, механический контакт и связывание Р-ворсинок с клеткой эпителия ведут к изменению механизма сборки новых ворсинок (они становятся короче) и являются сигналом к экспрессии ряда генов вирулентности E.coli (комплекса рар и гемолизина). (3) Адгезины ряда микроорганизмов, в частности Porphyrominas gingivalis, одновременно являются факторами вирулентности.


Молекулярные механизмы адгезии

Для установления адгезионного контакта бактериальная клетка и клетка-мишень должны преодолеть электростатическое отталкивание, так как их поверхностные молекулы в норме несут отрицательный заряд. Сахаролитические бактерии обладают необходимым ферментным аппаратом для отщепления отрицательно заряженных фрагментов.
Возможны и гидрофобные адгезивные контакты между бактериями и эпителиоцитами слизистых. (9)Адгезия микроорганизмов к поверхности эпителия слизистой может также осуществляться при помощи фимбрий, упорядоченно расположенных нитевидных выростов на поверхности бактериальных клеток.(10)

Молекулярный механизм бактериальной адгезии является универсальным для патогенных и комменсальных форм, что подтверждено на примере микрофлоры верхних дыхательных путей, нижних отделов пищеварительного и мочеполового трактов. (11) Основой взаимодействия любых биоло­гических систем и межклеточных коммуникаций служит лиганд-рецепторное узнавание, (12, 13)при котором меньший по размерам и молекулярной массе участник называют лигандом (например, поверхностные структуры клеточной стенки бактерий), а его более крупный комплементарный партнер — рецептором (например, сайты связывания на цитолемме эукариотической клетки).
Лиганды и рецепторы представляют собой полимеры гликолипидной или гликопротеинной природы, состоящие из множе­ственных копий уникальных в каждом случае субъединиц и определяющие тропизм различных патогенов к своим клеткам-мишеням. (14) Именно последнее обстоятельство способствует колонизации бакте­риями тканей макроорганизма с повышенной плотностью рецепторов.(13)

In vivo на процесс адгезии существенное влияние оказывают растворенные компоненты биологических жидкостей и секретов, с которыми патогены чаще встречаются до контактов с клетками-мишенями и которые по химическому строению аналогичны клеточным рецепторам. Orksov a. Birch-Anderson (1980) (15) продемонстрировали, что Е. coli адгезируют к муцину слюны раньше, чем к эпителию ротовой полости.


Факторы, влияющие на процесс адгезии

Показатели адгезии как многофакторного процесса зависят от большого числа условий, как со стороны бактерий, так и макроорганизма. Известно, что видовая принадлежность в значительной степени характеризует адгезивные свойства бактерий. Так, Streptococcus mutans практически не фиксируется на эпителиоцитах языка и щек, но необратимо прикрепляется к поверхности зубов. (16) Arbuthnott a. Smith (1979) (7) отмечают, что адгезивность St. pyogenes к эпителиальным клеткам ротовой полости в 6 раз выше, чем у Е. coli. Степень адгезивности, коррелирующая с вирулентностью, уменьшается у музейных культур и микроорганизмов, многократно пассированных через питательные среды. Для це­лого ряда микроорганизмов показана прямая связь степени гидрофобности клеточной поверхности и адгезивности. Так, St. aureus из гнойных очагов более гидрофобен, чем из окружающей среды, полости носа, поверхности кожи. (6)


Состояние макроорганизма – фактор регуляции адгезии

Адгезия является начальным и, безусловно, необходимым этапом любого инфекционного процесса. Поэтому вполне естественно, что многоклеточные организмы выработали систему защиты, ограничивающую адгезию. Эта способность организма чаще всего обозначается как колонизационная резистентность, и определяется как физиологический феномен, направленный на поддержание микроэкологического гомеостаза в результате симбиотических взаимодействий организма хозяина и аутохтонной микрофлоры. Колонизационная резистентность включает комплекс специфических факторов местного иммунитета, к которым принадлежат ингибиторы микробной адгезии, биоцидные и биостатические продукты секретов, нормальная микрофлора, механические факторы (мерцательный эпителий), антитела. (17)

Соответственно, к факторам, влияющим на адгезивные свойства тканей и клеток хозяина, относится индивидуальное состояние пациента. Например, у больных различными воспалительными заболеваниями отмечена высокая степень колонизации эпителиоцитов ротовой по­лости Str. pyogenes, у носителей наблюдается снижение этого показателя, а у здоровых людей - прак­тически полное отсутствие. (6) Существует разница в прикреплении микроорганизмов к разным участкам в пределах одного макроорганизма. Для Str. Salivarius и St. Aureus нижняя поверхность языка рассматривается как богатая рецепторами зона и наиболее благоприятная для инвазии область.

(16) На вариабельность рецепторного аппарата эпителиоцитов может оказывать влияние и гетерогенность клеточной популяции, обусловленная физиологическими изменениями поверхностных структур клеток при дифференциации или старении. Патологические изменения тканей макроорганизма создают дополнительные условия, способствующие адгезии микроорганизмов. (18)

Во взаимоотношениях макроорганизма с его микрофлорой в неблагоприятных условиях, вызванных различными воздействиями на организм (например, стресс) или на микробиоту (массивная антибиотикотерапия), симбиоз может превращаться в отношения взаимной агрессии. При этом оба участника обладают достаточным потенциалом, чтобы нанести друг другу существенный ущерб или «расчистить дорогу» для внедрения в организм настоящих патогенных микроорганизмов. В частности, эпителий может вырабатывать бактериостатические и бактерицидные ферменты (лизоцим, лактоферрин), в него начинают проникать активированные фагоцитирующие клетки (нейтрофилы). В свою очередь, это вызывает ответ в форме активации «ударного» ферментативного аппарата бактерий (нейраминидазы, гиалуронидазы), высвобождение эндотоксина и синтез прочих атрибутов вирулентности. (19)

Нормальная микрофлора макроорганизма слабо иммуногенна для хозяина из-за того, что клетки слизистых характеризуются низкой или поляризованной экспрессией так называемых toll-like рецепторов. Экспрессия этих рецепторов может усиливаться в ответ на медиаторы воспаления. (20)

Молекулярная эволюция эпителия слизистых проходила под давлением отбора, который способствовал уменьшению ответа организма на бактерии-комменсалы, при поддержании способности ответа на патогенные микроорганизмы. Иными словами, взаимоотношения между нормальной микрофлорой и слизистыми можно объяснить как результат конвергентной эволюции рецепторов и поверхностных молекул микроорганизмов и эпителиоцитов. Очевидно, что у этих микроорганизмов в ходе эволюции сложилась система, позволяющая избегать направленного противомикробного действия защитных сил человеческого организма. Можно сделать заключение, что защитные механизмы слизистой оболочки включают в себя много факторов и являются продуктом совместной деятельности макроорганизма и микрофлоры. В совокупности формируется «колонизационная резистентность» – способность микрофлоры и макроорганизма в кооперации защищать экосистему слизистых от патогенных микроорганизмов. (19)


Колонизация и биопленка

Известно, что в сравнении с простыми колониями более высоким патогенным потенциалом и одновременно большей устойчивостью к действию неблагоприятных факторов обладает биопленка. Зубной налет является одной из разновидностей биопленки. Оральные стрептококки, обладающие высокой адгезивностью к тканям полости рта за счет коадгезии создают условия для прикрепления микроорганизмов, не способных задержаться на поверхности зубов самостоятельно. Так Str.salivarius обладает коадгезией с Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, и Prevotella intermedia, что позволяет этим бактериям прикрепиться, а в последствии размножаться в составе зубного налета.

(21) При этом установлено, что факторы адгезии Porphyromonas gingivalis, особенно фимбрии II типа являются факторами, непосредственно связанными с деструкцией пародонта. (22) В свою очередь присутствие P. gingivalis обеспечивает коадгезию оральных стрептококков и s.aureus. (23)

Патогенность отдельных видов бактерий так же зависит от наличия или отсуствия представителей других видов. Так вирулентность A. actinomycetemcomitans в приутсвии P. gingivalis нейтрализуется, а в присутствии S. aureus возрастает. Бактериальное взаимодействие F. nucleatum с A. actinomycetemcomitans приводит к повышению цитотоксичности.(24) Аналогичные взамоотношения выявлены между кариесогенными стрептококками s.mutans и s.sobrinus. При одновременном присутствии этих бактерий риск кариеса резко возрастает. (25)

Описанные феномены вероятнее всего связаны с тем, что на уровне индивидуальной клетки экспрессия генов вирулентности регулируется одновременно несколькими системами. Иерархически наиболее высоким уровнем регуляции вирулентности, вероятно, является феномен кооперативной чувствительности. В наиболее общем виде данный феномен можно рассматривать как пример социального поведения бактерий, поскольку его смысл заключается в модификации физиологических функций бактерий в ответ на изменение их численности.

Наиболее детально изучена роль кооперативной чувствительности в регуляции вирулентности P.aeruginosa. Под контролем этой системы находится образование биопленок, синтез практически всех внеклеточных энзимов, проявляющих токсические свойства. Блокада кооперативной чувствительности приводит к резкому снижению вирулентности P.aeruginosa при экспериментальных инфекциях. Аутоиндукторы контролируют синтез основных токсинов и у S.aureus.(26)


Регуляция адгезии как способ профилактики инфекционного процесса

Изучение молекулярной природы лиганд-рецепторных комплексов, образующихся при взаимодействии различных бактерий с соответствующими им клетками-мишенями, а также факторов, влияющих на процесс адгезии in vivo и in vitro, позволяет разработать профилактические меры, направленные на подавление ранних этапов инфекционного процесса.

В основе поисков антиадгезивных препаратов лежит создание эффективных препятствий с разнообразными механизмами действия при установлении взаимодействия между лигандами и рецепторами. Одним из наиболее известных механизмов, с учетом которого осуществляется подбор ингибиторов процесса адгезии, является введение в систему бактерии – эукариотические клетки растворимых веществ, конкурирующих с лигандами или рецепторами за места связывания на клеточных поверхностях. (13)

При этом все растворимые соединения можно разделить на две группы, способные реагировать либо с бактериальными, либо с эукариотическими клетками. Избирательное связывание лигандов микроорганизмов предпочтительнее, так как в меньшей степени влияет на рецепторный аппарат клеток-мишеней, а через него на самые разнообразные процессы в тканях макроорганизма. (27)

К настоящему времени известны многочисленные экспериментальные доказательства того, что применение природных или синтетических аналогов клеточных рецепторов и компонентов тканевых жидкостей способно значительно снизить, а в отдельных случаях и полностью предотвратить прикрепление микроорганизмов к клеткам хозяина. (13, 28, 27) Установлены факты взаимодействия бактериальных лигандов с белками, гликопротеинами плазмы крови (иммуноглобулинами классов А и G, Р2-микроглобулином, фибриногеном, фибронектином, альбумином, трансферрином, а также некоторыми другими (6, 28 и 29), мочи (ТН-белком) (30, 31), слюны (муцином, агглютининами) (32), что позволило использовать большинство из перечисленных выше соединений в экспериментальных и клинических условиях в качестве ингибиторов бактериальной адгезии.

На основе слюнных Ig-A и (32) агглютининов созданы антикариесные препараты, снижающие прикрепление оральных стрептококков к эмали зубов и тормозящиеобразование кариесных бляшек. Помимо агглютининов и Ig-Aсильным ингибитором бактериальной адгезии в ротовой полости является гликопротеин слюны – муцин. По мнению некоторых исследователей (27) он обладает идеальными для этой роли свойствами: отличается большой молекулярной массой и высоким содержанием остатков N-ацетилнейраминовой кислоты, что способствует в значительной степени установлению специфического лиганд-рецепторного взаимодействия.

(27) По сравнению с мономерной N-ацетилнейраминовой кислотой эффективная в отношении подавления бактериальной адгезии концентрация муцина снижается в 100 раз. На основе результатов исследований по взаимодействию бактерий и растворимого, а также входящего в рецепторный аппарат клеток фибронектина может быть создан новый перевязочный материал, существенно сни­жающий обсемененность тканей в ране. (6)

Современные исследования в области создания новых лекарственных препаратов для профилактики инфекционных заболеваний должны быть направлены на поиски соединений, сочетающих антимикробную активность со способностью подавлять бактериальную адгезию.

Успехи в выделении бактериальных лигандов, их идентификации и очистке послужили основой для разработки антиколонизационных вакцин, механизм действия которых включает два аспекта:
1) конкурирование за места связывания на кле точных рецепторах между целыми бактериями и свободными фрагментами их лигандов,
2) стимулирование выработки защитных антител, также вовлекаемых в антиадгезивную защиту хозяина. (33, 34) Одним из недостатков антиколонизационных вакцин может стать их иммуногенность для организма хозяина, что связано с антигенной гетерогенностью штаммов, выделенных из различных источников. (13) Важным этапом в разработке эффективных антиколонизационных вакцин широкого спектра действия является подбор активных фрагментов лигандов нескольких видов бактерий, наиболее часто вызывающих инфекционные осложнения. (14)

Сегодня имеются данные об антиадгезивном действии некоторых природных агентов, в частности способность подавлять адгезию описана у полисахарида ламинарии фукоидана (35), алкалоида берберина (36), а так же у протеолитических ферментов.(37)


Антиадгезивное действие зубной пасты «R.O.C.S.. для взрослых».

Полученные в процессе клинических исследований данные о значительном улучшении гигиенического состоянии полости рта, отмеченная и исследователями и испытуемыми задержка скорости отложения зубного налета(38, 39) побудили нас к проведению дополнительных исследований влияния протеолитического фермента бромелаина (одного из ключевых компонентов запатентованного состава) на антиадгезивные свойства .

В современной литературе имеются сведения о способности протеолитических ферментов влиять на процессы адгезии. Прежде всего речь идет о расщепляющем действии протеолитических ферментов на белки. У грамположительных бактерий фимбриальные адгезины не описаны. Эти микроорганизмы осуществляют адгезию посредством афимбриальных адгезинов. Структура многих афимбриальных адгезинов не установлена, большинство из известных афимбриальных адгезинов являются белковыми молекулами.
Возможно, именно поэтому зубные пасты, содержащие протеолитические ферменты существенно повышают качество удаления зубного налета. Таким образом, действие ферментов приводит к нарушению уже сформированных колоний и как продемонстрировано в экспериментах in vitro за счет такого влияния фермента усиливается действие антибактериальных препаратов на биопленку.

(37) В этой же работе было отмечено, что действие ферментов проявляется в достаточно низких концентрациях, что указывает на специфичность антиадгезивного эффекта. Разные ферменты демонстрируют различный уровень противоадгезивного влияния, что объясняет наблюдаемые в клинических условия различия зубных паст, содержащих разные ферменты.

В исследовании, проведенном под руководством профессора Г.Е Афиногенова, изучалось влияние зубной пасты «R.O.C.S», содержащей протеолитический фермент ананаса бромелаин на адгезию микроорганизмов полости рта к кожно мышечным фибробластам эмбриона человека. Контролем служила зубная паста аналогичной рецептуры без бромелайна.

Тест-культуры микроорганизмов: Клинические штаммы микроорганизмов, выделенные из ротовой полости волонтеров: Staphylococcus aureus 20, Streptococcus salivarius 67, Streptococcus sangius 12, Streptococcus sobrinius 83.

Выбранные для тестирования микроорганизмы группы стрептококков обладают способностью к адгезии как к мягким тканям полости рта, так и к зубам.

- Streptococcus salivarius присутствует в полости рта в 100% случаев, обнаруживается главным образом на поверхности языка и слизистой (40), одним из первых задерживается на поверхности зубов. Способствует адгезии ряда пародонтопатогенов: Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, and Prevotella intermedia. (41)
- Streptococcus sangius 12/2/, обнаруживается в большом количестве на зубах (на гладких поверхностях) Выявлена коадгезия Str. sangius с Candida Albicans. (42)
- Streptococcus sobrinus – микроорганизм ассоциированный с кариесом. (38, 6, 43)Установлено, что смешанные колонии S.sobrinus и s.mutans демонстрируют значительно более высокий кариесогенный потенциал, чем моноколонии этих микроорганизмов.
- Staphylococcus aureus – в условиях зубной бляшки повышает уровень вирулентности.

Было показано, что эффективность исследованных зубных паст для подавления адгезии нормальной микробиоты ротовой полости зависит от экспозиции: причем более продолжительная экспозиция зубной пасты (2-часа) оказалась менее эффективной, а при времени выдержки 3 минуты – она резко возросла – до 70-80% подавления адгезии штаммов микроорганизмов.

Эти результаты не только продемонстрировали эффективность ферментсодержащей зубной пасты, но и подтвердили, что рекомендуемая продолжительность применения зубной пасты позволяет существенно подавить адгезию клинических штаммов микроорганизмов, выделенных из ротовой полости волонтеров к тканям человека. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности зубной пасты с бромелаином, как средства для профилактики формирования микробной биопленки в полости рта. (44)

* Материал предоставлен компанией

19.12.06